Clonage, surexpression et purification de la RDH8 en fusion avec plusieurs étiquettes dans le but de mesurer son activité enzymatique

Authors: Lemay-Lefebvre, Charlotte
Advisor: Salesse, Christian
Abstract: La rétinol déshydrogénase 8 (RDH8) est impliquée dans le cycle visuel où elle réduit le tout-trans rétinal en tout-trans rétinol, ce qui prévient l’accumulation de lipofuscine (A2E), une molécule toxique qui peut mener à la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Il y a malgré tout une accumulation d’A2E dans les photorécepteurs et l’épithélium pigmentaire rétinien, ce qui suscite des interrogations à propos de son efficacité enzymatique. Il est donc important de caractériser ses propriétés enzymatiques pour clarifier cette question. La RDH8 est insoluble dans le lysat bactérien suite à sa surexpression dans un système E. coli. Il est cependant possible de la solubiliser en utilisant le détergent SDS, ce qui résulte en la production d’une protéine inactive et empêche ainsi la caractérisation de son activité enzymatique. Différentes approches ont donc été utilisées pour produire la RDH8 en absence de détergent. La première approche comprend l’ajout d’un ligand ou d’un cofacteur à la RDH8 lors de la surexpression et de la lyse cellulaire, afin de la rendre plus soluble. La deuxième approche consiste à utiliser la technologie des protéines de fusion afin d’obtenir une forme soluble de la RDH8 en fusion avec les étiquettes poly-His, MBP, TagR-TagR, NusA ou SUMO. La dernière approche comporte l’utilisation du système d’expression L. lactis pour permettre la sécrétion de la RDH8 dans le milieu de culture. Il a été impossible d’obtenir une forme soluble et pure de la RDH8 en raison de sa faible solubilité, de la protéolyse observée lors de la production des différentes protéines de fusion, ainsi que de l’absence d’expression dans le système L. lactis. La surexpression de la RDH8 en fusion avec différentes étiquettes dans les cellules eucaryotes Pichia pastoris pourrait toutefois permettre l’obtention d’une forme soluble de la RDH8 et la caractérisation de son activité enzymatique.
Document Type: Mémoire de maîtrise
Issue Date: 2020
Open Access Date: 7 March 2020
Permalink: http://hdl.handle.net/20.500.11794/38218
Grantor: Université Laval
Collection:Thèses et mémoires

Files in this item:
Description SizeFormat 
35784.pdf5.25 MBAdobe PDFThumbnail
View/Open
All documents in CorpusUL are protected by Copyright Act of Canada.