Recherche d'un rôle physiologique essentiel pour la bétalactamase et caractérisation d'une activité beta-lactamase dans les cellules de foie de rat

Authors: Couillard, Michel
Advisor: Pechère, J.-C.
Abstract: Cette étude a eu pour but d'élucider le rôle physiologique de l'enzyme ß-lactamase. Nous avons postulé que la ß-lactamase n'est pas exclusivement de nature bactérienne, qu'elle est reliée à une fonction physiologique importante et que cette fonction peut se retrouver chez les mammifères. Nous avons d'abord entrepris de vérifier le concept d'universalité des ß-lactamases. Des méthodes sensibles de détection ont été appliquées afin de mesurer la capacité de souches bactériennes, dites ß-lactamases-négatives, de synthétiser cette enzyme. La présence de ß-lactamase a semblé être une caractéristique commune aux bactéries grain-négatives. Une souche de Mycoplasma pneumoniae n'a montré aucune activité de ce type. Chez les micro-organismes à Gram positif, les actinomycètes Bifidobacterium et Propionibacterium ont montré une faible activité ß-lactamase. Deux Peptococcus anaerobius et un Peptostreptococcus productus n'ont pas révélé d'activité ß-lactamase décelable. Ces deux espèces sont des bactéries anaérobies strictes. Cette observation suggère que la ß-lactamase peut jouer un rôle dans le métabolisme aérobie des cellules productrices. Nous avons ensuite réalisé des expériences métaboliques avec des souches d'entérobactéries afin de vérifier si la synthèse de ß-lactamase est accrue en aérobiose. Nous avons mesuré l'effet de l'oxygène sur la synthèse de ß-lactamases inductibles et constitutives, en présence ou non de cyanure de potassium. De plus, l'influence de la pénicilline, de la source d'énergie et de la composition du milieu de culture sur le taux de synthèse de ß-lactamase fut évaluée en présence et en absence d'oxygène. L'aérobiose ainsi que le milieu minimal ont augmenté les niveaux des ß-lactamases d'Enterobacter et de Citrobacter. Le cyanure de potassium a freiné l'effet inducteur de 1'oxygène en aérobiose. Ce résultat semble suggérer que la synthèse de g-lactamase dépend davantage du fonctionnement normal de la chaîne des transporteurs d'électrons que de l'influence directe de l'oxygène à d'autres niveaux métaboliques. Nous avons justifié la nécessité de réaliser ce type d'expériences avec des souches microbiennes génétiquement définies. A la suite de ces observations, nous avons dirigé nos efforts vers la mise en évidence et la caractérisation d'une activité g-lactamase dans des cellules de mammifères. Les méthodes d'études ont été basées sur 1 'interaction des protéines de rat avec une gamme d'antibiotiques appartenant aux principaux groupes de ß-lactamines. Les résultats ont indiqué que le surnageant 100,000 g d'un homogénat de foie de rat peut dégrader les ß-lactamines. L'activité a été jugée complexe. L'inactivation de deux céphalosporines chromogéniques, le PADAC (pyridinium-2-azo-p-diméthy 1-ani 1ine chromophore) et la nitro- céfine, a semblé reposer sur deux mécanismes différents. Les caractéristiques spectrophotométriques de ces deux substrats et de leurs produits de dégradation ont rappelé une activité de type g-lactamase. Nous avons déterminé l'absence de relation avec d'autres protéines capables de réagir sur les g-lactamines comme la peptidase rénale, l'albumine et l'acylase. La présence d'une ß-lactamase dans les cellules de foie de rat pourrait contribuer à élucider son rôle physiologique essentiel. Dans cette perspective, nous avons entrepris de purifier l'activité ß-lactamase des cellules de foie de rat. Les tentatives entreprises afin d'isoler la protéine responsable de l'hydrolyse du PADAC ont échoué. Chaque étape de purification a été caractérisée par une faible récupération de l'activité enzymatique et, par conséquent, une perte d'activité spécifique. Nous avons d'abord attribué ce résultat à une grande instabilité de l'enzyme. La recherche des conditions optimales pour stabiliser cette protéine a permis de déterminer qu'elle nécessite la présence d'un cofacteur, le NADPH. Elle possède un poids moléculaire voisin de 25,000 et un point isoélectrique d'environ 7.7. Elle a réagi aussi avec quelques pénames et céphèmes. La protéine qui a dégradé la nitrocéfine possède un poids moléculaire inférieur à celle qui a hydro lysé le PADAC et un point isoélectrique près de 5.4. Elle a réagi avec un pénème et un monobactame. Ces propriétés n'écartent pas la possibilité qu'il s'agit de g-lactamases. Cependant, l'appartenance définitive de ces protéines à la famille des ß-lactamases devra attendre leur purification complète.
Reproduction Note: Montréal Trigonix inc. 2018
Document Type: Thèse de doctorat
Issue Date: 1985
Open Access Date: 19 February 2019
Permalink: http://hdl.handle.net/20.500.11794/33651
Grantor: Université Laval
Collection:Thèses et mémoires

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