Caractérisation de la protéine spermatique bovine P80 et étude de son rôle au cours de l'interaction entre les gamètes

Authors: Morin, Guillaume
Advisor: Leclerc, PierreSullivan, Robert
Abstract: Il est reconnu que le passage de la matrice extracellulaire du cumulus ainsi que de la zone pellucide par le spermatozoïde sont assurés, chez plusieurs espèces de mammifères, par la protéine spermatique PH-20. Cette protéine possède une activité hyaluronidase qui lui permet de cliver les liens d'acide hyaluronique contenus dans le cumulus et est responsable de la liaison du spermatozoïde ayant subi la réaction de l'acrosome à la zone pellucide. Une protéine spermatique bovine de 80 kDa (p80) possédant une homologie aVec PH-20 fut identifiée au sein de notre laboratoire. Puisque PH-20 n'est pas identifiée chez le bovin, les travaux présentés dans cette thèse étaient destinés à déterminer si la protéine p80 est la PH-20 bovine et si elle est impliquée dans l'interaction entre les gamètes au cours de la fécondation. Dans un premier temps, la caractérisation de la protéine fut effectuée à l'aide d'une approche PCR et immunologique. L'homologie entre la protéine spermatique bovine p80 et PH-20 fut établie à l'aide de ces résultats. L'analyse de la séquence déduite en acides aminés de p80 a permis de mettre en lumière la présence de caractéristiques uniques chez la protéine dont l'absence d'une ancre-GPI, la présence d'un domaine transmembranaire, de sites de phosphorylation et de N- et O-glycosylation. Deuxièmement, à l'aide du développement d'un anticorps dirigé contre l'extrémité C-terminale de p80 et d'un anticorps dirigé contre l'extrémité N -terminale, l'orientation de p80 dans les membranes spermatiques fut établie. Les résultats montrent que deux populations de p80 existent chez le spermatozoïde bovin. La première est internalisée dans la région antérieure de la tête des spermatozoïdes alors que la deuxième est localisée dans la région post -acrosomale de la tête et expose son domaine hyaluronidase à l'environnement extracellulaire. De plus, les analyses protéomiques et immunologiques démontrent que la population post-acrosomale est un isofo~e plus court de p80 et est d'origine épididymaire alors que la forme pleine longueur présente dans la région antérieure de la tête du spermatozoïde est d'origine testiculaire. La présence de sites d'O-glycosylation fut aussi confirmée expérimentalement. Afin de déterminer le rôle fonctionnel de p80, l'état de phosphorylation sur les résidus tyrosines de la protéine au cours de la capacitation et de la réaction de l'acrosome fut étudié. De même, l'implication de p80 dans la modulation de la concentration des niveaux de calcium intracellulaire spermatique en présence d'acide hyaluronique ainsi que son implication au cours de l'interaction entre le spermatozoïde et la zone pellucide furent déterminées. Les résultats démontrent que p80 n'est pas phosphorylée sur ses résidus tyrosines au cours de la capacitation et de la réaction acros·omique et n'est pas impliquée dans la modulation des concentrations de calcium intracellulaire. Toutefois, p80 est impliquée, via son extrémité C-terminale, dans la liaison du spermatozoïde à la zone pellucide puisque la présence de la protéine purifiée ainsi que l'anticorps C-terminal de p80 dans le milieu inhibe cette liaison. De plus, la glycosylation de la protéine n'est pas responsable de son interaction avec la zone pellucide puisque la présence de la forme déglycosylée de p80 dans le milieu d'incubation produit le même taux d'inhibition que sa forme native. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent clairement que la protéine p80 est la PH-20 bovine, que deux populations sont présentes sur le spermatozoïde et qu'elle est responsable de l'activité hyaluronidase requise par le spermatozoïde pour franchir le cumulus ainsi que pour l'interaction entre ceux -ci et la zone pellucide entourant l'ovule au cours de la fécondation.
Document Type: Thèse de doctorat
Issue Date: 2009
Open Access Date: 13 April 2018
Permalink: http://hdl.handle.net/20.500.11794/20605
Grantor: Université Laval
Collection:Thèses et mémoires

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