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Développement et application de nano-architectures cœur-coquille fluorescentes pour la mesure du pH

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2018
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Les variations ioniques entrent en jeu dans presque tous les processus métaboliques cellulaires et bactériens. Par le fait même, leur dysfonctionnement induit une modification des concentrations attendues et provoque des maladies graves à même la solution physiologique ou le tissu biologique affecté. Parmi ces différents facteurs, le pH est un paramètre-clé régissant plusieurs activités comme la capacité enzymatique, la conformation tridimensionnelle des protéines et l’activation de certains transporteurs membranaires. Lors de ces travaux de doctorat, des nanoparticules fluorescentes sensibles au pH ont été développées et appliquées sous la forme d’un substrat lamellaire implantable directement dans l’environnement de culture de cellules. Ce nouvel outil analytique adapté pour la recherche biomédicale in vitro offre donc la possibilité de visualiser le pH en microscopie de façon quantitative avec une résolution spatiale (~1 μm) et temporelle (<300 ms). Pour ce faire, les nano-capteurs ont été optimisés dans le cadre d’une étude paramétrique structurale. Ces nanoparticules comportent un coeur métallique offrant une activité plasmonique qui permet d’exalter la fluorescence de chromophores incorporés dans une coquille de silice. La taille, la distance d’espacement, et le degré de recouvrement entre la bande plasmonique et le spectre d’excitation/émission de différents fluorophores ont donc été ajustés afin de rentabiliser la portée de l’effet amplificateur de ces architectures concentriques. Comme la chimie d’encapsulation des molécules sensibles est généralisable pour un grand nombre de précurseurs silanes, une démonstration a été faite pour un concept de nanoparticules multicouches permettant simultanément la détection multiélémentaire de la concentration en protons et en ions halogénure (Cl-, Br-, I-), et aussi la correction de ces signaux par rapport à une référence interne. La normalisation ratiométrique permet de compenser pour les fluctuations et erreurs expérimentales issues notamment de la concentration des capteurs, du photoblanchiment et de l’intensité de la source en fonction du temps. Finalement, cette stratégie a été appliquée dans une étude spectroscopique utilisant la fluorescéine dans des nanoparticules coeur-coquille en tant que rapporteur ratiométrique pour la mesure quantitative du pH dans des cultures cellulaires. Pour ce faire, les nano-architectures ont été fonctionnalisées, puis confinées en surface d’un substrat de silice par voie de couplage clic complémentaire. Ces lamelles de microscopie à valeur ajoutée offrent donc une surface adaptée pour la culture de cellules excitables comme les fibroblastes cardiaques et les neurones, mais aussi pour la croissance bactérienne de biofilms et l’analyse multiphase en microfluidique.
Ionic gradient changes are essential in almost every cellular and bacterial metabolic processes. Therefore, any malfunction that perturbs these ion concentrations can induce major illnesses in the affected physiological solution or biological tissue. Amongst all the chemical species influenced by cell metabolism, protons are key to many events; enzyme activity, protein structural changes, and activation of membrane transporters. In this doctoral thesis, pH-sensitive fluorescent nanoparticles were developed and grafted on planar substrates in order to probe the culture medium of different cells in vitro. These innovative analytical tools for biomedical research offer the possibility to image quantitative pH values in microscopy with both spatial (~1 μm) and temporal resolutions (<300 ms). As such, the sensors were optimized in a structural parametric study with regards to the nanoarchitecture design. These particles comprise a metallic core with plasmonic properties to enhance the fluorescence of molecules incorporated into a porous silica shell. The core size, the spacing layer thickness, the spectral overlap between the plasmon and the fluorescence excitation/emission bands, and the sensitive moieties were carefully chosen to take advantage of the plasmonic range of enhancement in concentric architectures. Since the covalent encapsulation of molecules is highly adaptable for many silanized fluorophores, core-multishell architectures were synthesized as a proof of concept which allows simultaneous measurements of pH and halides (Cl-, Br-, I-), and signal normalization with an internal reference onto the same nanoparticle. The ratiometric correction compensates for fluctuations in light intensity and experimental errors with sensor concentration, photobleaching and environmental effects as a function of time. Finally, this analytical strategy was applied in a spectroscopic study of fluorescein-doped nanoparticles as quantitative pH-sensitive markers implemented in biological cell cultures. Particularly, the core-shell nanoarchitectures were functionalized with a silane component and immobilized at the surface of a silica substrate by way of complementary click coupling. These improved microscope coverslips were evaluated as a fluorescent sensing surface for the culture of adhesive excitable cells – e.g. cardiac fibroblasts and neurons, but also for the growth of bacterial biofilms and the study of multiphase interfaces in microfluidic devices.
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thèse de doctorat