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Caractérisation structurale et dynamique de la Beta-Lactamase TEM-1 de la bactérie Escherichia coli par RMN liquide

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2008
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La résistance aux antibiotiques chez les bactéries pathogènes représente un obstacle majeur dans notre bataille contre les maladies infectieuses. La cause principale est la production par les bactéries de β-lactamases, des enzymes capables de cliver les antibiotiques à noyau β-lactame. TEM-1 est la β-lactamase la plus fréquemment en cause et elle est la source prédominante de résistance aux pénicillines et céphalosporines. Bien que cette protéine soit très étudiée, certaines subtilités de son mécanisme d’action demeurent incomprises. Cette thèse présente les résultats obtenus de sa caractérisation par RMN. Nous avons effectué l’attribution des déplacements chimiques des résonances des atomes de cette protéine qui compte 263 résidus (28,9 kDa). Comme l’analyse de la dynamique interne des enzymes est essentielle à la compréhension des processus impliqués dans leurs mécanismes d’action, nous avons étudié les propriétés dynamiques de TEM-1. Les données expérimentales enregistrées (R1, R2 et NOE {¹H}-15N) nous ont permis de calculer les paramètres caractérisant les mouvements internes de la protéine. Nos résultats mettent en évidence l’extrême rigidité de TEM-1 sur l’échelle de temps des picosecondes-nanosecondes. Par ailleurs, nous avons observé la présence de mouvements lents (μs-ms) affectant la relaxation de résidus présents dans la boucle Ω ainsi que dans le site actif. La détermination de la structure de TEM-1 en solution nous a fourni d’autres indices de la présence de ces mouvements qui sont probablement impliqués dans la catalyse. Comme il a été proposé que la Tyr105 ait un rôle à jouer dans la reconnaissance et la fixation des substrats chez TEM-1, nous avons étudié les effets de différentes mutations de ce résidu par RMN. Nos résultats indiquent que l’environnement ainsi que les mouvements de plusieurs autres résidus ont été altérés suite à ces mutations. Comme certains de ces résidus sont éloignés du site actif, nous croyons que des mouvements concertés entre les résidus situés à proximité et ceux éloignés du site actif puissent jouer un rôle important pour la fonction de TEM-1. Ces travaux apportent de toutes nouvelles données sur TEM-1 et possiblement sur les autres β-lactamases de classe A, contribuant ainsi significativement à l’amélioration des connaissances dans le domaine de la résistance aux antibiotiques.
Antibiotic resistance in pathogenic bacteria represents a major obstruction in our struggle against infectious diseases. The main cause of this resistance is the production by bacteria of enzymes called β-lactamases which possess the ability to hydrolyse the amide bond of β lactam antibiotics. TEM-1 β-lactamase is the most frequently implicated and is the major source of resistance to penicillins and cephalosporins. Although being extensively studied, subtleties in the mechanism of action of this protein remain misunderstood. This thesis presents the results obtained from TEM-1 characterisation by NMR. We carried out resonance assignment for this 263 residues protein (28.9 kDa). As the analysis of internal dynamics of enzymes is essential for the understanding of processes implicated in their mechanism of action, we studied the dynamic properties of TEM-1. Experimental data (R1, R2, and {¹H}-15N-NOE) allowed us to characterize internal motions. Our results highlight the extreme rigidity of TEM-1 on the picosecond to nanosecond timescale. In addition, we observed the presence of slow motions (μs-ms) affecting the relaxation of residues located in the Ω-loop and in the vicinity of the active site. Elucidation of TEM-1’s 3-D structure in solution provided us with additional evidences of the presence of these movements which may be involved in catalysis. As it was proposed that Tyr105 could play a role in substrate recognition and binding in TEM-1, we studied the effects of several mutations at this position. Our results indicate that the environment as well as motions of several other residues were affected by these changes. As some of these residues are far from the active site, we believe that concerted motions between residues located in the vicinity and those further from the active site can play an important functional role in TEM-1. This work brings new data on TEM-1 and possibly on other class A β-lactamases, thus contributing significantly to the improvement of knowledge in the domain of antibiotic resistance.
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Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2008-2009
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thèse de doctorat