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Caractérisation de l'activité 3'-5' AMPC-PDE dans le plasma séminal et fluides épididymaires bovin

Au moment de l'éjaculation, les spermatozoïdes sont exposés à des protéines sécrétées par le testicule, l'épididyme, les vésicules séminales et les glandes sexuelles accessoires. Tous ces tissus contribuent, de par leurs sécrétions, à la formation du plasma séminal. Malgré le fait que 70% des protéines totales qui constituent le plasma séminal proviennent de la famille des «heparin-binding proteins», nous avons mesuré de l'activité 3'-5'AMPc-PDE grâce à des essais enzymatiques. Après avoir déterminé les conditions optimales de l'essai (2uL de plasma séminal frais), nous avons mesuré une activité enzymatique de 11.35±0.85 fMol d'AMPc hydrolizé/minutes/u.g de protéines (n=18). De plus, nous avons réalisé la même expérience sur des aliquots du plasma séminal préalablement analysé et conservé à -80°C, après l'avoir décongelé une fois. Les données suggèrent que l'activité enzymatique totale n'est pas altérée dans ces conditions (10.05±3.96 fMol/min/ug protéines (n^lO). Aussi, en déterminant l'activité 3'-5' AMPc-PDE sensible à différents inhibiteurs nous avons constaté que l'activité totale est inhibée de 70% lorsque l'échantillon est en présence d'IBMX (7.16±0.87 fMol/min/ug de protéines), de 20% lorsqu'en présence de Cilostamide (1.68±0.27 fMol/min/ug de protéines) et de 50% lorsqu'en présence de Papaverine (4.8±0.53 fMol/min/ug de protéines). Ceci nous a permis de dresser le profil des PDE contribuant à l'activité totale dans le plasma séminal bovin. Grâce à une technique de chromatographie échangeuse d'ions, nous avons purifié la protéine responsable de l'activité 3'-5' AMPc-PDE prépondérante (PDE 10) dans le plasma séminal bovin. Afin de vérifier sa présence dans les fractions recueillies d'intérêt, nous avons réalisé des analyses d'immunobuvardages en utilisant un anti-PDE10 monoclonal. Les deux bandes immunoréactives détectées ont un poids moléculaire d'approximativement 75kDa et 65kDa. Finalement, nous avons extrait l'ARN des tissus suivants : testicule, tête et queue de l'épididyme et vésicules séminaux afin de vérifier si le transcrit de PDE 10 se retrouvaient dans ceux-ci. Nous avons détecté une bande à la hauteur attendue (502 paire de bases) pour tous les tissus et l'homologie des produits PCR avec la séquence prédite de Bos taurus (XM582454, pubmed) est de plus de 90%.