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Protection des protéines recombinantes sécrétées chez l'hôte d'expression "Nicotiana benthamiana" par expression hétérologue du canal ionique M2 du virus de l'Influenza

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2017
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Les systèmes d’expression végétaux sont utilisés couramment pour la production hétérologue de protéines recombinantes complexes. Des contraintes biochimiques dans le système de sécrétion cellulaire, comme l’abondance de protéases peu spécifiques ou des variations de pH d’un organite à l’autre, compromettent toutefois l’expression de plusieurs protéines d’intérêt. Des approches ont été développées pour améliorer l’environnement intracellulaire dans la plante hôte de manière à accroître la qualité et le rendement des protéines sécrétées. Dans ce projet, nous avons évalué l’impact de l’homéostasie du pH dans le système de sécrétion cellulaire des feuilles du Nicotiana benthamiana sur l’expression et la stabilité des protéines recombinantes. Nous démontrons le potentiel du canal ionique M2 du virus de l’Influenza comme nouvel outil pour augmenter le pH des compartiments acides du système de sécrétion cellulaire, une approche éventuellement utile pour la stabilisation des protéines sensibles aux milieux acides. En lien avec l’influence bien documentée du pH sur l’activité des protéases cellulaires, nous montrons ensuite qu’une modification du pH induite par l’expression du canal M2 influence les profils de dégradation de protéines de fusion sensibles à la protéolyse, des observations qui confirment l’impact du pH sur l’activité protéolytique des cellules végétales et qui suggèrent le potentiel du canal ionique M2 comme protéine accessoire pour augmenter la stabilité et le rendement des protéines recombinantes in planta. Finalement, nous abordons l’impact du canal ionique M2 sur l’expression des protéines endogènes à l’échelle de la cellule. Nous démontrons qu’une altération du pH dans le système de sécrétion en réponse à l’expression du canal ionique a des effets étendus sur le protéome foliaire, affectant la teneur de protéines retrouvées dans plusieurs compartiments cellulaires incluant les chloroplastes, le cytosol et la vacuole. Nous rapportons aussi l’établissement d’un ‘protéome hybride’ dans les plantes exprimant M2, composé de protéines caractéristiques aussi bien de plantes témoins non infectées que de plantes agroinfectées exprimant activement des protéines de défense. En résumé, nos données mettent en évidence le rôle de l’homéostasie du pH sur le protéome des cellules végétales et l’impact significatif du gradient de pH dans le système de sécrétion cellulaire sur la stabilité et le rendement des protéines recombinantes sensibles à l’acidité ou à la protéolyse.
Plant expression systems are commonly used for the heterologous production of complex recombinant proteins. However, biochemical conditions in the plant cell secretory pathway, such as the presence of poorly-specific proteases or pH variations from one organelle to another, impair the expression of several potentially useful proteins. Approaches have been developed to improve the cellular environment of the host plant in such a way as to increase the quality and yield of secreted recombinant proteins. In this project, we assessed the impact of pH homoeostasis in the leaf cell secretory pathway of wild tobacco Nicotiana benthamiana on the expression and stability of recombinant proteins. We demonstrate the potential of Influenza virus proton channel M2 as a new tool to increase pH in acidic compartments of the cell secretory pathway, eventually useful to stabilize acid-labile recombinant proteins. In line with the well-established influence of pH on cell protease activities, we then show that pH modification induced by the expression of the M2 channel influences the degradation profile of fusion proteins susceptible to proteolysis, thus confirming the impact of pH on protease activities in plant cells and highlighting the potential of M2 as an accessory protein to increase the stability and yield of recombinant proteins in planta. Finally, we describe the impact of the M2 proton channel on the expression of endogenous proteins at the cellular scale. We show that pH alteration in the secretion system upon M2 expression has cell-wide effects on the leaf proteome, affecting the content of proteins found in various cell compartments including the chloroplast, the cytosol and the vacuole. We report the establishment of a ‘hybrid proteome’ in leaf cells expressing the proton channel, composed of protein clusters characteristic of both control, non-infected plants and agroinfected plants actively expressing defense-related proteins. Overall, our data highlight the central role of pH homeostasis on the proteome of plant cells and the strong impact of pH gradient in the cell secretory pathway on the stability and yield of acidic pH-labile and protease-susceptible recombinant proteins.
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thèse de doctorat