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Role of Lmx1a and Lmx1b transcription factors in post-mitotic midbrain dopaminergic neurons

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2016
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Lmx1a et Lmx1b sont des facteurs de transcription connus pour leur rôle au cours du développement des neurones dopaminergiques du mésencéphale (mDA). Ils ont été montrés comme essentiels à chacune des étapes de différentiation des progéniteurs en neurones dopaminergiques matures. Des études récentes ont également mis en évidence l'importance de ces deux facteurs de transcription dans les neurones dopaminergiques chez l'adulte. Lmx1a/b sont impliqués dans la régulation de gènes mitochondriaux ainsi que dans l'autophagie. Cependant, jusqu'à présent, rien n'est connu sur le rôle de Lmx1a/b dans les neurones dopaminergiques post-mitotiques. Le but de cette thèse est d'élucider le rôle de Lmx1a/b dans les neurones dopaminergiques matures. L'analyse des projections axonales dopaminergiques de souris doubles conditionnelles mutantes (cKO) pour Lmx1a/b a mis en évidence un défaut de guidage axonal confirmant le rôle essentiel de ces deux facteurs de transcription dans la formation des circuits dopaminergiques. Afin d’identifier précisément les molécules impliquées dans la régulation du système dopaminergique des techniques adaptées doivent être développées pour déterminer les principaux acteurs régulés par Lmx1a/b. À cette fin, nous avons mis au point une technique de marquage immunohistochimique rapide de la tyrosine hydroxylase (TH, enzyme nécessaire à la synthèse de la dopamine) sur des sections de mésencéphale de souris afin de délimiter la région d’intérêt. Par la suite, nous utilisons une technique de microdissection au laser afin de spécifiquement récolter les cellules dopaminergiques du mésencéphale pour réaliser un profil d'expression génique. Un premier article de méthodologie a été publié concernant cette technique. Cette procédure menée sur des souris cKO pour Lmx1a et Lmx1b et leurs contrôles associés a permis de mettre en évidence des gènes régulés par Lmx1a et Lmx1b tels que Plxnc1. Plxnc1 est une protéine de guidage axonal ayant pour ligand la sémaphorine 7a (Sema7a). Afin d'observer si la régulation de Plxnc1 par Lmx1a/b est à l'origine du défaut de guidage axonal observé chez les souris cKO pour Lmx1a/b, nous avons réalisé une analyse in vitro de l’effet de la Sema7a sur les axones d'explants mDA. Notre étude a montré un effet chimiorépulsif de la Sema7a pour les axones des neurones mDA exprimant Plxnc1. De plus, l’étude de souris Sema7a KO montre une augmentation de l’innervation DA dans la partie dorsale du striatum, partie exprimant Sema7a chez des souris contrôles. Ce phénotype met en évidence une chimiorépulsion induite par l’interaction Sema7a/Plxnc1. L’étude de souris surexprimant Plxnc1 a, quant à elle, montré une perte d’innervation DA dans la partie dorsale du striatum. En effet, la majorité des cellules du mésencéphale se mettent à exprimer Plxnc1, les rendant ainsi sensibles à la chimiorépulsion induite par Sema7a. L’ensemble de ces résultats met en évidence l’importance de la régulation de la protéine de guidage axonal Plxnc1 par Lmx1a/b pour l'innervation des cibles du mésencéphale. La répression de Plxnc1 dans les neurones dopaminergiques de la substance noire pars compacta (SNpc) semble nécessaire à l’innervation du striatum dorsal riche en Sema7a. Cette étude est la première à identifier les bases moléculaires du guidage axonal expliquant la ségrégation des voies mDA nigrostriée et mésolimbique, et devrait contribuer à améliorer l'efficacité des thérapies cellulaires pour la maladie de Parkinson. Un second article sera soumis prochainement sur le rôle des facteurs de transcription Lmx1a/b dans les neurones dopaminergiques post-mitotiques du mésencéphale. La principale caractéristique histopathologique de la maladie de Parkinson est la dégénérescence des neurones mDA de la SNpc. La thérapie de remplacement cellulaire utilisant des neurones dopaminergiques nouvellement générés à partir de cellules souches représente une thérapie prometteuse. Cependant, la mauvaise innervation des neurones nouvellement greffés limite le succès des études de transplantation. L’identification de facteurs régulant la connectivité des neurones mDA devient primordiale pour élucider les mécanismes impliqués dans la mise en place du système dopaminergique. C'est pourquoi, dans une derniere partie, afin d'illustrer cette possibilité d'amélioration d'une thérapie de remplacement cellulaire, j’ai réalisé l’implantation de cellules souches différenciées en neurones dopaminergiques dans un modèle de souris lésées à la 6-hydroxydopamine (6OHDA). Les cellules nouvellement réimplantées sont de type SNpc, en raison de l'infection par un vecteur viral induisant l'inhibition de l'expression de Plxnc1.
Lmx1a and Lmx1b are transcription factors known for their role in the development of midbrain dopamine neurons (mDA). They were shown as essential for each stage of differentiation from progenitors to mature dopaminergic neurons. Recent studies have also highlighted the importance of these two transcription factors in dopaminergic neurons in adult mice. Lmx1a/b are involved in the regulation of mitochondrial genes and in autophagy. Although some evidence suggest that they could be involved in the formation of mDa circuit formation, their role in post-mitotic mDA neurons remains unknown. The aim of this thesis is to elucidate the role of Lmx1a/b in post-mitotic dopaminergic neurons. Analysis of dopaminergic axonal projections of double conditional mutant (cKO) mice for Lmx1a/b showed an axon guidance defect confirming the essential role of these transcription factors in the formation of dopaminergic circuits. In order to precisely identify the molecules involved in the regulation of the dopamine system, suitable techniques must be developed to identify the main genes that are regulated by Lmx1a/b. To this end we developed a new technique allowing gene profiling of brain sub-population. By combining rapid immunolabeling of mDA neurons with laser capture microdissection we manage to extract RNA from two sub-regions of mDA neurons such as ventral tegmental area (VTA) and substantia nigra pars compacta (SNpc). The advantage of this technique is to compare quickly the regulation of genes expression by studying controls and mutant mice. A first methodological article has been published regarding this procedure. We then applied this technique on cKO mice for Lmx1a/b and their associated controls to identify genes regulated by Lmx1a and Lmx1b. Among these genes, we identified Plxnc1, an axon guidance receptor for the semaphorin 7a (Sema7a). In order to verify whether the regulation of Plxnc1 by Lmx1a/b is at the origin of the axon guidance defect observed in double conditional mutant for Lmx1a/b, we have made an in vitro analysis of the effect of Sema7a on mDA explants. Our study showed a chemorepulsive effect of Sema7a on Plxnc1 positives axons. In addition, the study of knockout mice for Sema7a shows an increase of DA innervation in the dorsal part of the striatum which is the region expressing Sema7a in control mice. This phenotype reveals a chemorepulsion induced by Sema7a/Plxnc1 interaction. The study of mice overexpressing Plxnc1 shows a loss of DA innervation in the dorsal striatum. Indeed, by overexpressing Plxnc1, the majority of midbrain cells begin to express this axon guidance protein instead of only mDA neurons from the VTA. Thus, all mDA neurons including neurons from the SNpc express Plxnc1 making them sensitive to Sema7a. This interaction Sema7a/Plxnc1 leads to a chemorepulsion of axons guided away from the dorsal striatum. Overall these results highlight the importance of the regulation of the axon guidance protein Plxnc1 by Lmx1a/b for the innervation of midbrain targets. The repression of Plxnc1 expression in dopaminergic neurons of the SNpc appears necessary for the innervation of dopaminergic axons in the dorsal striatum, rich in Sema7a. This study is the first to identify the molecular basis of the development of the dopaminergic system explaining the segregation of the nigrostriatal and mesolimbic pathways. These results should help to improve the effectiveness of cell therapies for Parkinson's disease. A second article will be submitted soon about the role of Lmx1a/b transciption factors in post-mitotic midbrain dopaminergic neurons. The main histopathological feature of Parkinson's disease (PD) is the degeneration of SNpc neurons. The cell replacement therapy using newly generated dopaminergic neurons from stem cells represents a promising therapy. However, a poor innervation of the newly grafted neurons limits the success of transplantation studies. The identification of factors regulating neuronal connectivity of mDA neurons becomes essential to elucidate the mechanisms involved in the establishment of the dopaminergic system. Therefore, in a final section of this thesis, I report preliminary study about cell replacement therapy in PD mouse model. I differentiated DA neurons from stem cells, knock-down Plxnc1 expression and performed grafting in 6-hydroxydopamine (6OHDA) mouse model to illustrate the possibility of improving a cell replacement therapy.
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thèse de doctorat