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Motions, order and consistency : a story based on the study of the dynamics of the class A beta-Lactamase PSE-4 by NMR

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2010
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Partie I L’analyse de données de relaxation des spins à l’aide de l’approche model-free est très répandue pour obtenir des informations sur la dynamique des protéines aux échelles de temps ps-ns et μs-ms. Afin d’extraire des informations de qualité, les données sont enregistrées à plusieurs champs magnétiques. Combiner de telles données est cependant sujet aux erreurs expérimentales. Ainsi, la consistence des données de relaxation à plusieurs champs doit être vérifiée. Malheureusement, cela s’effectue rarement, i.e. on assume simplement que les données sont correctes. Nous proposons donc une approche simple pour la vérification de la consistence de données de relaxation enregistrées à plusieurs champs. L’utilisation des test proposés améliore l’analyse et réduit la présence artéfactuelle d’échange conformationnel. Ainsi, comme les données d’échange conformationnel sont souvent discutées en terme de liaison de substrat ou de catalyse, s’assurer de leur validité améliore la compréhension biologique du système étudié. Partie II Les b-lactamases de classe A sont impliquées dans la résistance aux antibiotiques. Elles y participent en hydrolysant les b-lactamines. Ces enzymes ont été étudiées par différentes approches : études mutationnelles, simulations de dynamique moléculaire, cristallographie des rayons X et RMN. L’enzyme modèle de cette classe, TEM-1, a précédemment été étudiée par RMN dans notre laboratoire. TEM-1 est très rigide sur l’échelle de temps des ps-ns, mais subit des mouvements lents μs-ms au niveau du site actif. Afin de mieux caractériser la dynamique des b-lactamases de classe A, l’homologue PSE-4 a aussi été étudié par RMN avec des données de relaxation des spins, de dispersion de relaxation par CPMG et d’échange d’amides. Les mêmes conclusions que pour TEM-1 ont été obtenues : rigidité générale élevée et présence de mouvements lents près du site actif. Ces mouvements pourraient être conservés chez les b-lactamases de classe A et ainsi avoir un lien avec la catalyse enzymatique. Cette hypothèse est renforcée par les données RMN pour cTEM-17m, une chimère TEM-1/PSE-4, pour laquelle plusieurs résonances près du site actif sont non observées dû à un élargissement causé par ces mouvements lents.


Part I The analysis of spin relaxation data using the model-free formalism is a widely used approach to get insights into protein dynamics on the ps-ns and μs-ms timescales. In order to extract high quality data, multiple magnetic field datasets are required. Combining datasets recorded using different NMR magnets is prone to experimental errors. Hence, the consistency of multiple field spin relaxation data must be carefully verified. Analysis of multiple field spin relaxation data generally proceeds without verification of consistency, i.e. with only the assumption that data is fine. We propose a simple approach to verify the consistency of multiple field relaxation data. Using the proposed tests improves the analytical approach by reducing the presence of artifactual conformational exchange terms. Since these terms are often rationalised in relation with ligand binding or catalysis, improving their confidence yields a better understanding in terms of biology. Part II Class A b-lactamases are involved in antibiotics resistance. They do so by hydrolysing the b-lactam antibiotics. These enzymes have been widely studied by different approaches including mutational studies, MD simulations, X-ray crystallography and NMR. The model enzyme for this class of proteins, TEM-1, has previously been studied by NMR in the laboratory. It was observed that TEM-1 is a highly ordered protein on the ps-ns timescale, with slower μs-ms motions clustered around the active site. In order to characterize further the backbone dynamics of class A b-lactamases, the homologous enzyme PSE-4 was studied by NMR using different approaches such as spin relaxation, CPMG relaxation dispersion, and amide exchange experiments. The same conclusions as for TEM-1 were obtained with a high rigidity along the sequence balanced by slower motions in the vicinity of the active site. These motions might be conserved in class A b-lactamases and potentially be important for catalysis. This hypothesis is further enforced by the backbone resonance assignments for cTEM-17m, a TEM-1/PSE-4 chimera, where many resonances are unobservable around the active site, potentially suffering from line broadening caused by slow motions.

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thèse de doctorat