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Personne :
Méthot, Mario

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Nom de famille

Méthot

Prénom

Mario

Affiliation

Université Laval. Département de biochimie, de microbiologie et de bio-informatique

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ncf11873350

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Résultats de recherche

Voici les éléments 1 - 1 sur 1
  • PublicationAccès libre
    Caractérisation des interactions de la phospholipase A₂ gamma cytosolique et de la retinol dehydrogenase 11 avec des membranes lipidiques modèles
    (2010) Méthot, Mario; Salesse, Christian
    L'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est constitué d'une monocouche de cellules tapissant le fond de l'oeil et est localisée de façon apicale par rapport à la rétine neurale. Outre ses fonctions au niveau du cycle visuel, PEPR permet aussi la phagocytose des segments externes des bâtonnets (SEB) et la production de phagosomes. L'EPR digère ces phagosomes à l'aide d'enzymes telles les phospholipases A₂ (PLA₂) et recycle certaines de ses composantes tels les acides gras polyinsaturés (AGPI). Fait notable, plus de 60% des acides gras des phospholipides des SEB sont polyinsaturés. Ces membranes sont donc très susceptibles à l'oxydation. Il a déjà été démontré dans notre laboratoire que PEPR exprime une PLA₂ gamma cytosolique (cPLA₂ gamma). La spécificité et l'activité constitutive de cette PLA₂ suggèrent qu'elle pourrait participer au recyclage des AGPI. Les objectifs poursuivis dans cette partie de la thèse étaient de surexprimer, de purifier la cPLA₂ gamma et de caractériser ses propriétés enzymatiques et de liaison avec des modèles membranaires. Au niveau des interactions membranaires, nous avons d'une part démontré que la cPLA2-gamma recombinante était active, hydrolysant le L-DPPC en monocouche ainsi que le PAPC en vésicules (résultats non-montrés). Il s'agit selon nous de la première fois où une cPLA2-gamma recombinante issue d'un système prokaryote, dépourvue des modifications postraductionnelles associées à celle produite à partir du système eukaryote, notamment la farnésylation de son extrémité C-terminale et de nombreux sites potentiels de palmitoylation et d'un site de myristoylation (Tucker et al., 2005), était démontrée active. La vision chez les vertébrés commence avec l'absorption de lumière par les pigments visuels dans les cellules des photorécepteurs. Les pigments visuels, ou opsines, sont des récepteurs à sept hélices transmembranaires couplés aux protéines G localisés dans la membrane des disques des segments externes des bâtonnets et des cônes. Dans l'obscurité, le chromophore sensible à la lumière, le 11 cis retinal, est lié de manière covalente à l'opsine via un lien de base de Schiff à un résidu de lysine spécifique localisé au centre de la septième hélice alpha transmembranaire. La stimulation lumineuse a pour résultat Pisomérisation du 11-cis rétinal en tout-trans rétinal, ce qui cause un changement dans la conformation de la rhodopsine. La métarhodopsine II photoactivée résultante réagit avec la protéine G, appelée transducine, et déclenche la cascade de phototransduction qui mène à u l'hyperpolarisation des photorécepteurs et, finalement, à l'inhibition du relargage de neurotransmetteur au niveau de la terminaison synaptique. Après isomérisation du 11-cis-rétinal à la configuration tout-trans, la base de Schiff est hydrolysée et le chromophore photolyse se détache de l'opsine. Le tout-trans rétinal est alors réduit en tout-trans rétinol par une rétinol dehydrogenase (RDH) localisée dans la membrane discale des segments externes des photorécepteurs (Blaner et al, 1980; Nicotra et Livrea, 1982; Ishiguro et al, 1991; Palczewski et al, 1994). Les enzymes spécifiques responsables de cette réaction sont la RDH8 et la RDH 12 (Molday et al., 2009; Rattner et al., 2000; Maeda et al., 2006, Maeda et al. 2009). Six RDHs distinctes exprimées dans les photorécepteurs ont été récemment clonées. Leurs fonctions, in vivo, demeurent inconnues, mais elles ont toutes démontré leur capacité à réduire le tout-trans rétinal in vitro (Kasus-Jacobi et al. 2006). Plusieurs évidences suggèrent que cette réduction du tout-trans rétinal dans les cellules des photorécepteurs est cruciale pour le maintien du caractère fonctionnel et de l'intégrité structurale de la rétine. Cette réaction est la première étape d'une voie métabolique appelée le cycle visuel, lequel est essentiel pour une phototransduction soutenue. Cette voie intervient au niveau des photorécepteurs et de l'épithélium de pigment rétinien (EPR) et permet de recycler le tout-trans rétinal en 11-cis rétinal. Quand le tout-trans rétinol issu de la réduction du tout-trans rétinal est produit dans les photorécepteurs, il est transporté dans PEPR où il est estérifié par la lécithine rétinol acyl transferase (LRAT) et est emmagasiné sous forme de tout-trans rétinyl ester. Le tout-trans-rétinol peut aussi être acheminé à PEPR par la vascularisation choroïdienne, entrant dans PEPR via un processus récepteur-dépendant impliquant un complexe de protéine/transthyretin - protéine sérique liant le rétinol (SRBP) (Malpeli et al., 1996). Les rétinyl esters emmagasinés dans PEPR constituent le substrat pour Pisomérohydrolase (IMH), aussi appelée RPE65, une enzyme dont le rôle proposé serait de catalyser l'hydrolyse concertée du tout-trans rétinyl ester et l'isomérisation en 11-cis rétinol. L'oxydation du 11 cis-rétinol en 11-cis rétinal par la 11 cis rétinol dehydrogenase (RDH5) et/ou la RDH11 dans PEPR complète le cycle visuel. Le 11-cis rétinal est ensuite réacheminé vers les photorécepteurs où il se combine avec l'opsine pour régénérer la rhodopsine photosensible. La première étape du cycle visuel est importante parce qu'elle produit du tout-trans rétinol, utilisé pour approvisionner PEPR en Ill rétinyl ester. U ne s'agit cependant pas de Punique source de tout-trans-rétinol puisque celui en circulation dans l'organisme peut également être utilisé de façon alternative. À ce jour, on connaît encore peu de choses sur ces enzymes. Il est connu que des mutations de la RDH5 sont associées avec la maladie récessive rare fundus albipunctatus, alors que des mutations de la RDH 12 causent l'amaurose congénitale de Leber. Cependant le rôle physiologique exact de plusieurs autres isozymes de la RDH et de leur implication possible dans des pathologies de l'oeil demeurent toujours inconnus jusqu'à maintenant. L'objectif de ces travaux consistait à surexprimer et purifier la RDH 11 et une forme tronquée (N-delRDHll) pour ensuite mesurer ses interactions membranaires et, finalement, déterminer sa structure tridimensionnelle. Lors de cette étude, nous avons obtenu deux versions de la RDH-11, soit une version complète comportant les 318 acides aminés, ainsi qu'une version tronquée comportant une deletion des 26 premiers acides aminés en N-terminal que l'on appelera N-delRDHll tout au long de cette thèse. La version N-delRDHl 1 fut produite par génie moléculaire en raison du très faible niveau d'expression et de solubilité de la version complète de la RDH-11. Les meilleurs essais de purification ont produit une N-delRDHll d'une pureté supérieure à 95% et d'une concentration d'environ 1 mg/ml, ce qui nous a permis de tenter la cristallogénèse de cette protéine, malheureusement sans succès. Nous avons de plus démontré que la N-delRDH 11 surexprimée dans un système prokaryote était active, convertissant rapidement le tout-trans rétinal en rétinol. Or, il s'agit à notre connaissance de la première fois qu'une activité était démontrée pour une protéine issue d'un tel système d'expression. Les mesures effectuées en pression de surface ont permis d'établir comment la présence du segment N-terminal, sans être le seul élément nécessaire à la liaison membranaire, venait néanmoins accélérer grandement la cinétique de mobilisation de la protéine du coeur de phase jusqu'à l'interface. Cependant, ce segment N-terminal n'aurait pas d'effet significatif sur la pression d'insertion maximale (PIM) sous une monocouche de DOPE. Par ailleurs, les mesures de PIM avec les lipides comportant deux chaînes grasses 18:1 nous ont également permis de constater des différences significatives entre les différentes têtes polaires des phospholipides testés.